青霉素的发现使大家对由病原微生物感染而引发的各类疾病不再束手无策,并由此进步了很多的β-内酰胺类抗生素,对保护人类健康作出了巨大贡献。但伴随上述“传统抗生素”的广泛用,不断产生出很多新问题。如β-内酰胺类抗生素的过敏反应与长期用致使抗药菌株的产生。于是大家开始探寻新一代抗菌剂。最近的研究发现,某些阳离子型多肽具备广谱的抗菌活性,同时具备“传统抗生素”没办法比拟的优越性:不会诱导抗药菌株的产生,有期望成为新一代抗菌剂[1]。抗菌肽是具备抗菌活性短肽的总称。1975年瑞典科学家G.Boman等人[2]等从惜古比天蚕蛹中诱导离别得到一种杀菌肽,并将它命名为cecropin。此后,很多抗菌肽相继被离别、纯化。一些抗菌肽的氨基酸一级结构和基因序列得到确定。80年代,有关抗菌肽的研究主要集中在大型的经济昆虫。90年代以来,在继续对大型经济昆虫进行研究的同时,又扩展到一些小型昆虫和其它无脊椎及脊椎动物,抗菌肽已成为免疫学和分子生物学研究的热门。研究的内容包含:抗菌肽的离别与纯化,氨基酸序列的剖析,蛋白质构型与功能的关系,抗菌肽有哪些用途机理[3,4],应用基因工程克隆与表达抗菌肽基因,改造合成抗菌肽基因与动植物的转抗菌肽基因工程等,其中昆虫抗菌肽基因工程研究最受看重[5,6]。现在已发现抗菌肽或类似抗菌肽的小分子肽类广泛存在于生物界,包含细菌、动植物和人类。这种内源性的抗菌肽经诱导而合成,在机体抵抗病原的入侵方面起着要紧有哪些用途,更被觉得是缺少特异性免疫功能生物的要紧防御成分。抗菌肽具备广谱杀菌用途,大部分对革兰氏阳性菌有较强的杀灭用途,有的则对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均起用途。对某些真菌、原生动物,特别对耐药性细菌有杀灭用途,并能选择杀伤肿瘤细胞,抑制乙型肝炎病毒的复制。1. 抗菌肽的分类迄今为止从不同生物体内诱导的抗菌肽已不下200种,仅从昆虫体内离别获得的就多达170余种。依据抗菌肽的结构,可将它分为5类:单链无半胱氨酸的抗菌肽,或由无规则卷曲连接的两段а-螺旋组成的肽。该类包含天蚕素Cecropins, Magainins等。Magainins刚开始是从非洲爪蟾的皮肤中发现的,它是爪蟾的皮肤在肯定的环境重压下分泌出的抗感染和促进伤口愈合的成分,由两个紧密相连的肽链组成,每个肽链有23个氨基酸,低浓度便可抑制很多细菌和真菌成长[7]。富含某些氨基酸残基但不含Cys的抗菌肽。如富含脯氨酸或甘氨酸残基的抗菌肽。如从猪肠内离别的抗菌肽PR39中Pro含量占49%[6]。鞘翅肽Coleoptericin和半翅肽Hemiptericin的全序中富含Gly[8]。含一个二硫键的抗菌肽,该二硫键的地方一般在肽链C端。如爪蟾皮肤细胞中产生的Brevinins[9]。有两个或两个以上二硫键,具备β 折叠结构的抗菌肽。如绿蝇防御素,分子内有6个Cys形成3个分子内二硫键,肽链C末段是带有拟β 转角的反向平行的β片层[10]。实验证明,分子中的二硫键在其抗菌用途中至关要紧。由其他已知功能较大的多肽衍生而来的具备抗菌活力的肽。2. 抗菌肽有哪些用途及机理2.1抗菌肽的抗菌用途及其机理抗菌肽分子可以在细菌细胞质膜上穿孔而形成离子孔道,导致细菌细胞膜结构破坏,引起胞内水溶性物质很多渗出,而最后致使细菌死亡。抗菌肽分子第一结合在质膜上,接着其分子中的疏水段和两亲性α-螺旋也插入到质膜中,最后通过膜内分子间的相互位移,抗菌肽分子聚集形成离子性通道,使细菌失去了膜势而死亡[10-14]。但,Gazit[15]等得出的实验结果表明,抗菌肽只不过结合到了单位膜的表面上,并未插入膜中,更未形成通道。然而,抗菌肽有哪些用途靶部位是细菌细胞质膜,与抗菌肽有哪些用途结果是致使细菌细胞质膜通透性增大等基本内容是确切无疑的,这也正是抗菌肽与青霉素等传统抗生素对细菌用途机制不一样的本质所在。2.2抗菌肽的抗病毒用途及其机理研究发现烟芽夜蛾幼虾的血淋巴对6种DNA、RNA病毒有明显的抑制用途,使病毒感染力飞速减少,而且这种抗病毒活性具备广谱性。Mariam [16]试验表明源自爪蟾的抗菌肽Magainins及其它Magainins类抗菌肽具备抗疱疹病毒-HSV有哪些用途,还发现人的嗜中性粒细胞防御素对一种疱疹病毒有抑制用途。除此之外,蜂毒素和天蚕素也可以在亚毒性浓度下抑制艾滋病毒HIV-1的基因表达,从而抑制降低HIV-1的增殖。这表明抗菌肽对于当今人类的顽症———艾滋病也有抑制用途。2.3 抗菌肽的抗寄生虫用途及其机理抗菌肽可以有效地杀灭产生人类及动物寄生虫病的寄生虫,如疟疾、Chagas氏病、莱什曼病等。现在发现一种合成的天蚕素-蜂毒素杂合体对莱什曼原鞭毛虫有损伤用途,起用途的靶目的是细胞质膜,它可以迅速减少H- OH+的通透性,破坏膜电势,质膜形态也遭到损毁。Shahabudpn[17]研究发现昆虫抗菌肽对感染蚊子的疟原虫发育的不同时期有不一样的用途,主要对疟原虫的卵囊期和子孢子期导致明显的损伤。2.4 抗菌肽对肿瘤细胞用途及其机理国内外已对抗菌肽杀伤肿瘤细胞有哪些用途进行了广泛研究,发现抗菌肽对体外培养的癌细胞有哪些用途主如果使癌细胞膜上形成孔洞,内容物外泄,线粒体出现空泡化,嵴掉落。核膜界限模糊不清,有些核膜破损,核染色体DNA断裂,并抑制染色体DNA的合成,细胞骨架也遭到一定量的损伤[18,19]。通过对荷瘤小鼠的研究证明,抗菌肽能显著抑制ECA腹水瘤荷瘤小鼠腹水的积累;对S180肉瘤和U14宫颈癌的抑瘤率亦达30%-50%[20]。抗菌肽还可以调动机体的免疫机能,从体液免疫方面来抵抗癌瘤的入侵。3. 抗菌肽基因的融合表达 抗菌肽的天然产量低,合成或从机体中提取步骤复杂、产率低、价格相当昂贵,借助基因工程技术生产抗菌肽具备要紧意义。抗菌肽所携带的碱性氨基酸使其对蛋白酶很敏锐,需要使用融合表达方案以抵消其碱性并减少其对宿主细胞的毒性。谢维等合成了家蚕抗菌肽CMIV基因,并将它克隆到金黄色葡萄球菌A蛋白和IgG亲合的结构域ZZ的融合表达载体中,得到Pezz318-CMIVV质粒,以此质粒转化E.coliHB101,得到ZZ-CMIV融合表达的蛋白,用CBr切割后,得到CMIV肽。李秀兰等[21]对天然抗菌肽CMIV的氨基酸序列作了50%的改动,依据E.coli偏爱的密码子人工合成了肽基因片断,重组到测序载体,再将此片断重组到表达载体Pet28上进行表达,融合蛋白经CNBr裂解后,具备与天然抗菌肽相同的生物活性。吴映雅等将柞蚕抗菌肽Ｄ基因连接在牛成纤维细胞成长因子cDNA的上游,在酵母中成功地得到了表达,表达产物具备抗菌活性和牛成纤维细胞成长因子的抗原性。Kevin等[22]HNP和CEME分别与GST、ORRF、IgG结合序列及SPA在E.coli或S.aureus中融合表达,结果在S.aureus中虽达成了与SPA的融合分泌表达,但表达产量较低;Zhang等[23]选择RepA蛋白的序列作为抗菌肽的融合表达伴侣,并插入Histag等序列作为纯化亲和位点,达成了在E.coli中的融合表达。Christsnen B等研究中得到的融合抗菌肽的抗菌活性比其任何一个供体抗菌肽的活性都高。4. 抗菌肽转基因研究 王志兴等把大麦α-淀粉酶的信号肽序列和抗菌肽Cecropin B基因或Hhiva A基因构成嵌合基因,并把此基因导入马铃薯,结果加信号肽序列的Cecropin B转基因植株发青枯病延迟,病情指数减少。Yarus等[24]用显微注射法将牛气管抗菌肽基因转入小鼠,转基因鼠在牛气管抗菌肽基因控制序列的驱动下成功的表达了牛气管抗菌肽,在鼠乳间宽的牛气管抗菌肽对大肠杆菌具备抗菌活性。Reed等研究了以IL-2启动子/增强子控制转基因鼠中抗菌肽的合成及随后对布氏杆菌的抑制用途。Reed[25]构建了如此一个DNA片断:Shivala片断,SV40多腺苷酸化/剪切信号肽基因片断,此片断加到鼠IL-2基因5’侧-593─+110地区。在受精卵精前核时将此融合基因注入受精卵,得到26系小鼠。RT-PCR测试:有两系转基因鼠,当其脾淋巴细胞置于3.25mg/kg的conA时,可以诱导产生成熟的Shivalam RNA。用适量的布氏杆菌接种时,有两系小鼠遭到攻击。四星期后,在转基因鼠脾脏组织布氏杆菌比非转基因鼠少得多。David Winder等[26]把编码Ceropin或Melittin的基因放置在MLV的启动子下,转染到EJ细胞,然后把这类细胞注入到裸鼠内,发现这类肿瘤细胞停止成长或成长减弱David Winder等用PCR扩增,Prepromelittin,Premelittin和Prececroppin三种核酸片断,均置于MLV启动子下构建融合基因转染进EJ细胞。三类型型的EJ细胞分别注入裸鼠后,测定50d后的肿瘤成长状况,无抗菌肽基因片断的EJ细胞致瘤率为70%,带Cecropin基因片断的EJ细胞致瘤率只有39%,PPM为50%,PM为65%,其抑制肿瘤的成效明显。5. 抗菌肽的应用前景 现在,大多数植物抗菌肽是从植物种子中离别获得的,它们可以保护植物组织和种子不受真菌病原菌的侵害,但植物抗菌肽对大多数细菌无抑制活性。因此,依赖基因工程的办法用其它真核生物的抗菌肽基因来转化农作物,培育抗病新产品种是目前国内外研究的一个热门。 动物抗菌肽和干扰素、补体一样是机体非特异性天然防御系统的要紧组成部分。机体受损伤或病原微生物入侵时,能飞速产生抗菌肽来杀伤入侵者,它对正常真核细胞几乎没用途。另外,由于抗菌肽的合成速度飞快,［27］而且小肽的扩散比大的蛋白质和免疫细胞愈加飞速,用途更显灵活,所以Boman曾指出,抗菌肽是机体的一种理想的一线防御物。与普通抗生素相比,抗菌肽的“抗菌谱”更广,除去抗细菌外,有些抗菌肽还能用途于真菌、原虫、有包膜的病毒及癌细胞,同时能加速免疫和伤口愈合过程。这预示抗菌肽在治疗及预防癌症和抗病毒、抗感染等方面具备好的应用前景。更为要紧的是,因为抗生素的滥用致使菌株产生了抗性,大家需要探寻新的抗菌药剂。抗菌肽这种从生物体中获得的物质恰巧具备独特的抗菌机理,不是像普通的抗生素那样通过阻断生物大分子的生物合成来发挥用途,因而极有期望开发成为一类新型的广谱高效抗菌药物。伴随研究工作的进一步深入,可以预见,抗菌肽及其基因工程在医药、卫生、食品工业及农业等方面将会发挥更为要紧有哪些用途。另外,有的抗菌肽分子中含有D-氨基酸,这也为研究D-氨基酸怎么样在核糖体上合成多肽提供了一个理想的模式体系。6. 研究展望及存在问题抗菌肽是哺乳动物防御系统的一个要紧组成部分,具备热稳定、水溶性好、广谱杀菌甚至有些能杀真菌、原虫等优点,而且很多抗菌肽在100℃加热10min条件下仍能维持肯定活力,且对较大的离子强度和较低或较高的ｐＨ都有较强的抗性,而对真核细胞几乎无用途,仅用途于原核细胞和发生病变的真核细胞,并且与抗生素通过阻断大分子生物合成有哪些用途机制完全不同,病源菌不容易对其产生耐药性,由此显示了它具备独特的研究和应用价值。近20年来,大家对昆虫抗菌肽已进行了比较系统的理论和应用研究,但有关畜禽抗菌肽基因工程应用研究方面的报道较少。从哺乳动物抗菌肽特有些性质,显示了它具备以下几个方面在畜牧生产上的研究和应用前景。研究展望及存在问题 6.1医用前景伴随传统抗生素的广泛及长期的应用,很多病源菌对它们产生了耐药性,而具备广谱抗菌且有独特的抗菌机制的抗菌肽显然在这方面的应用研究中具明显优势。伴随对抗菌肽结构与活性的关系、抗菌肽用途机制及其基因表达调控机制认识的不断深化,设计一种高效的、有益于人类健康的抗菌肽作抗生素替代品是完全可行的。6.2转基因研究及应用仔猪腹泻、奶牛胸部炎及各种病毒成人两性疾病如猪瘟、鸡新城疫等一直是棘手的疾病,不利于畜牧业的进步。借鉴已成功的昆虫抗菌肽转基因工程,如转基因蚊子、转基因马铃薯、转基因水稻等,把特异的抗菌肽基因转入畜禽特定细胞让其表达,从而产生抗病新产品种,不失为一条进步畜牧生产的新思路,前景深远。6.3抗菌肽基因表达调控及抗菌肽添加剂研究研究表明,［28］抗生素添加剂的用法紧急破坏了动物肠道的微生物平衡,并易在动物体内残留,严重干扰了畜商品的品质和人类的健康。用基因工程办法生产环保型抗菌肽添加剂,或者,通过日粮原因调控抗菌肽基因的表达而达到畜商品无抗素化值得进一步研究。然而,因为抗菌肽分子小,离别提纯存在肯定的困难,故天然资源有限。化学合成和基因工程法获得抗菌肽是主要方法,但化学合成抗菌肽本钱高,而通过基因工程在微生物中直接表达抗菌肽基因,则可能对宿主有害而不可以获得表达产物。所以,对抗菌肽的结构、构效关系及用途机理还需进一步研究。7. 结束语抗菌肽是生物体对外面病原物质侵染而产生的一系列免疫应答反应产物,它的出现为大家探寻理想的抗菌药物提供新的范围,特别是当今很多抗生素产生了耐药性,因此抗菌肽具备巨大的应用潜力。基因工程技术的进步,很大的促进了抗菌肽的研究和开发,通过抗菌肽基因的克隆与表达而很多生产成为可能。虽然抗菌肽现在还不可以直接应用于养殖业,但抗菌肽独特有哪些用途机理不容易产生耐药性的特质将吸引科研工作的不断深入,可以相信抗菌肽将在动物养殖和提升畜商品品质方面发挥要紧用途。参考文献［1］. 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